当怀疑患者得了脑干肿瘤时，一般会进行磁共振检查。核磁共振对于软组织的成像更加清晰，所以脑干上的一些细小变化能够早期快速发现。但是，如果要对肿瘤类型进行鉴别，可能就会需要做进一步检查，如MRS（磁共振波谱分析）和PET（正电子发射计算机断层显像），这些检查可以提供给医生更多肿瘤信息，有利于脑干肿瘤的诊断和治疗。
另外，有些脑干肿瘤可能无法通过上述这些无创性的影像学检查来明确，为了与其他疾病进行区别，就需要进行活检检查，即取一部分标本去做化验。
目前活检检查常使用无框架立体定向技术，可以非常精准地定位脑干上的某一个点进行特定取材，误差通常控制在一毫米以内。当然这种活检术也要看具体的病变部位，有些危险性很高的部位仍然不建议进行活检取材。
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